5分+肿瘤预后模型生信分析如何做？单细胞分析+干湿结合

今天给同学们分享一篇单细胞分析+干湿结合的生信文章“Tumor-associated endothelial cell prognostic risk model and tumor immune environment modulation in liver cancer based on single-cell and bulk RNA sequencing: Experimental verification”，这篇文章于2023年9月9日发表在Int Immunopharmacol 期刊上，影响因子为5.3。

全球肝癌发病率正逐渐上升。乙型病毒感染、丙型病毒感染和非酒精性肝炎已被确定为肝癌的主要危险因素。肝癌肿瘤微环境具有极强的异质性，包含基质细胞、各种免疫细胞和分化程度不同的肿瘤细胞。这一特点决定了肝癌患者从临床治疗中获益有限。

1.肝癌中肿瘤相关内皮细胞标记基因的鉴定

在对 GSE189903 中的单细胞测序数据进行质量控制后，39,092 个细胞和 20,543 个基因可用于下一步分析。共选择了 3000 个高变异基因进行 PCA 降维。降维结果经聚类后共得到 29 个细胞簇。经过 SingleR 软件注释和查阅以前的文献，16 个细胞群被注释为 TEC。通过 Wilcoxon-Mann-Whitney 检验，87 个细胞被认定为标记基因（图 1）。

图1 单细胞测序分析

2.肿瘤相关内皮细胞标记基因富集分析结果

GO和KEGG分析结果显示，TECs的标记基因主要与血管生成调控、血管生成、血管生成调控、细胞增殖、白细胞跨内皮细胞迁移、细胞粘附等特征有关（图2A，B）。

图2  GO 和 KEGG 富集分析结果气泡图

3. Building the model 3.3.建立模型

对这 87 个基因进行了单变量 Cox 回归分析，得出了 21 个与预后相关的基因。为避免模型过拟合，对单变量 Cox 回归结果进行了 LASSO 回归分析（图 2C，D）。对 LASSO 回归结果进行多因素 Cox 回归分析，以建立风险模型。最终将 IGFBP3、RHOC、S100A16、FSCN1 和 CLEC3B 纳入模型。

4. Model validation 3.4.模型验证

临床指标的单变量和多因素Cox回归分析表明，风险模型是一个独立的预后变量（图2E、F）。来自 ICGC 数据库和 GSE76427 数据库的患者作为独立验证集进行了验证。生存曲线显示，与低风险组相比，建模组和验证组的高风险组患者预后较差，差异有统计学意义（图 3A-C）。建模组和验证组的随时间变化的 ROC 曲线下面积均大于 0.700，表明风险模型具有突出的预测能力（图 3D-F）。热图显示，IGFBP3、RHOC、S100A16 和 FSCN1 在高风险组的表达高于低风险组。然而，CLEC3B 在低危组的表达高于高危组（图 4）。肝癌组织和正常组织中多个基因的蛋白表达量不同（图 5）。

图3 TCGA、GEO 和 ICGC 的 K-M 生存分析

图4 TCGA、GEO 和 ICGC 数据库的预后分析

图5

5.肿瘤突变负荷分析

肿瘤突变分析结果显示，高危组和低危组的前十大突变基因是一致的。但是，每个基因的突变类型各不相同。高危组和低危组的肿瘤突变负荷没有差异。但是，肿瘤突变负荷高组患者的生存率比肿瘤突变负荷低组患者差（图 6）。

图6

6.风险评分与肿瘤免疫微环境特征的相关性

CIBERSORT 的结果显示，高风险组和低风险组的 B 细胞、T 细胞、单核细胞、树突状细胞、肥大细胞和中性粒细胞的免疫浸润丰度存在显著差异（图 7A、B）。ssGSEA算法显示树突状细胞、CD8+ T 细胞、细胞溶解活性、巨噬细胞、NK 细胞、I 型 IFN 反应、II 型 IFN 反应、肥大细胞和中性粒细胞的活性存在差异（图 7C）。估算算法显示，高风险组的间质评分、总评分和肿瘤纯度评分均低于低风险组（图 7D）。风险模型与 CD8+ 细胞、CD4+ 细胞、B 细胞和 NK 细胞具有高度相关性（图 8）。

图7 (A、B）高危组和低危组免疫细胞浸润分析

图8 风险评分与免疫细胞的相关性分析

7.免疫疗法预测

TCIA 预测表明，低风险组对 PDL1 和抗 PD1 更有效（图 9A-D）。高风险组患者的 TIDE 评分高于低风险组患者，这表明高风险组免疫逃逸的可能性更大。高危患者从免疫检查点抑制治疗中获益较少。此外，两组患者的 CAF 评分、MDSC 评分、T 细胞功能障碍评分和 T 细胞排斥评分也各不相同（图 9E-H）。相关性分析发现，IGFBP3、FSCN1、风险模型和大多数免疫检查点阻断基因之间存在极高的相关性。风险模型基因是预测免疫检查点免疫疗法的有用工具（图 10A）。